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http://repositorio.utfpr.edu.br/jspui/handle/1/25527| Título: | Expressão, purificação e caracterização de uma catalase de Serratia marcescens |
| Título(s) alternativo(s): | Expression, purification and characterization of a catalase from Serratia marcescens |
| Autor(es): | Pacheco, Alberto Enrique Maestre |
| Orientador(es): | Bittencourt, Juliana Vitoria Messias |
| Palavras-chave: | Enzimas - Aplicações industriais Biotecnologia Peróxido de hidrogênio Catalase Serratia marcescens Enzymes - Industrial applications Biotechnology Hydrogen peroxide |
| Data do documento: | 18-Mai-2021 |
| Editor: | Universidade Tecnológica Federal do Paraná |
| Câmpus: | Ponta Grossa |
| Citação: | PACHECO, Alberto Enrique Maestre. Expressão, purificação e caracterização de uma catalase de Serratia marcescens. 2021. Dissertação (Mestrado em Biotecnologia) - Universidade Tecnológica Federal do Paraná, Ponta Grossa, 2021. |
| Resumo: | As enzimas constituem um fator fundamental em diversos processos indústrias devido a sua alta eficiência catalítica e o baixo consumo de energia. Dessa forma, os microrganismos graças ao seu rápido crescimento, versatilidade, altos níveis de produção, se tornam uma fonte importante de enzimas de interesse industrial; como as catalases, que são caracterizadas pelas suas aplicações em diferentes setores: alimentício, têxteis, farmacológico, odontológico, entre outros; contudo, existem algumas limitações para a produção de muitas enzimas microbianas por processos convencionais, uma dessas limitações é a dificuldade de mimetizar as condições ambientais e nutricionais para o crescimento de alguns microrganismos no nível laboratorial, assim, algumas técnicas da engenharia genética como a expressão heteróloga em diferentes sistemas de expressão, como a E. coli e a Pichia pastoris, constituem uma alternativa interessante dado que representam sistemas de expressão versáteis para a produção de inumeráveis enzimas e produtos de interesse biotecnológico a larga escala. Este trabalho tem como objetivo principal o estabelecimento de um sistema de expressão recombinante de uma catalase de Serratia marcescens em células de Pichia pastoris e E. coli. O fragmento Kat (codifica para uma catalase alcalina) da linhagem bacteriana Serratia marcescens FZSF01 foi subclonado previamente nos vetores de expressão pPICZαA e pET-28a. O plasmídeo recombinante pPICZαA_Kat foi utilizado para transformar células de P. pastoris KM71H e X-33, enquanto o vetor recombinante pET-28_Kat foi utilizado para transformar células de E. coli Rosetta(DE3). Os clones recombinantes de P.pastoris KM71H e X-33 foram induzidos com metanol (na concentração final de 0,75% e 1% respectivamente) por um período de 144 horas. A indução da expressão em E.coli foi feita com IPTG numa concentração final de 0,4 mM a 37ºC e a purificação foi realizada por cromatografia de afinidade em resina de níquel. A atividade enzimática da catalase purificada foi realizada pelo método espectrofotométrico. As análises de expressão e purificação foram feitas em SDSPAGE 12% corado com Comassie. A expressão da catalase em P. pastoris foi observada em pequena escala, sendo necessária a padronização dos ensaios de expressão a maior escala. Em células de E.coli Rosetta (DE3) apresentou significativas taxas de expressão, mostrando-se parcialmente solúvel o que permitiu realizar a purificação da proteína, obtendo-se um rendimento de 0,51 mg por litro de cultura. Posteriormente foram feitos os ensaios enzimáticos que demonstraram que a catalase estava ativa e que apresentou um comportamento Michaeliano. |
| Abstract: | Enzymes constitute a fundamental factor in a broad range of industrial process due to their high catalytic efficiency and low energy consumption. Thus, presenting a fast growth, versatility and high production levels, microorganisms become an important source of enzymes of industrial interest; such as catalases, which are characterized for by its applications in different sectors: food, textile, pharmacological, dental, among others. However, there are some limitations in the production of many enzymes through conventional process. One of them is the difficult in mimic the environmental and nutritional conditions for the growth of some microorganisms in laboratorial. So, some techniques of genetic engineering as heterologous expression in different expression systems, as Escherichia coli and Pichia pastoris, constitute an interest alternative, since they are versatile expression systems for the production of innumerable enzymes and products of biotechnological interest in large scale. This work has as main objective the establishment of a recombinant expression system of a catalase from Serratia marcescens in cells of Pichia pastoris and Escherichia coli. The Kat fragment (encoding an alkaline catalase) from bacterial strain Serratia marcescens FZSF01 was previously subcloned in the expression vectors pPICZαA and pET-28a. The recombinant plasmid pPICZαA_Kat was used to transform cells of P. pastoris KM71H and X-33, while the recombinant vector pET-28_Kat was used to transform cells of E. coli Rosetta (DE3). The recombinant clones of P. pastoris KM71H and X-33 were induced with methanol (final concentration of 0.75% and 1%, respectively) for a period of 144 hours. The induction in E. coli was made with IPTG in a final concentration of 0,4 mM at 37 ºC and the purification was made by affinity chromatography in nickel resin. The purified catalase enzyme activity was made by spectrophotometer method. Analysis of expression and purification were made in SDS-PAGE 12% colored with Comassie. Catalase expression in P. pastoris was observed in small scale, being necessary the standardization of the expression assays in a larger scale. In E. coli Rosetta (DE3) cells, it presented significative expression rates, presenting a partial solubility, which allowed the protein purification, obtaining a yield of 0.51 mg per liter of culture. After, it was done enzymatic assays that demonstrated that the catalase was active and it presented a Michaelian behavior. |
| URI: | http://repositorio.utfpr.edu.br/jspui/handle/1/25527 |
| Aparece nas coleções: | PG - Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia |
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